Lebih dari 120 tahun yang lalu Hans Christian Gram menemukan metode diferensiasi yang paling penting dalam bakteriologi yaitu pewarnaan gram. Sampai sekarang metode ini tidak banyak berubah sejak 1884 walaupun telah dilakukan beberapa modifikasi untuk meningkatkan efisiensi. Prosedur pewarnaan gram dinilai relatif sulit dalam prakteknya. Selain sukar memutuskan warna ungu atau merah, cara ini juga membutuhkan banyak biaya, waktu, reagen harus diganti secara berkala dan seringkali berantakan. Kekurangan ini disebabkan oleh adanya beberapa tahap yang membutuhkan perlakuan zat warna dan reagen selama satu menit lalu dilakukan pembilasan yang mungkin dapat tumpah di meja. Tahap krusial lain yang mungkin setiap orang berbeda adalah tahap dekolorisasi. Bisa saja kelebihan penambahan etanol menghasilkan sifat gram yang berbeda antara lab satu dengan lab yang lainnya.
Kurang lebih 60 tahun yang lalu dikembangkan metode lain yang lebih simpel dan cepat (tanpa menggunakan zat warna) untuk menentukan sifat gram dari suatu literatur di Jepang.
Cara kerjanya adalah sebagai berikut;
1. Teteskan 3% KOH cair pada slide (+/- 10 ul). 8-10 uji per slide masih dapat dilakukan dengan nyaman atau jika kurang yakin lakukan satu uji per slide.
2. Transfer sejumlah sel kasat mata dari kultur ke tetesan KOH menggunakan jarum inokulum (jumlah ini jangan terlalu sedikit).
3. Aduk sampai sempurna dengan diameter adukan +/- 1,5 cm.
4. Jika suspensi menjadi berlendir dalam waktu 5-60 detik maka dinyatakan sebagai gram (-). Untuk mengetahuinya ujung inokulum diangkat-angkat +/- 1 cm dari slide.
5. Jika tidak terdapat lendir dinyatakan sebagai gram (+) .
Semua tahap ini dapat dilakukan kurang dari 60 detik.
Efektivitas dari metode ini telah banyak diuji dan secara umum dapat dikatakan reprodusibel. Pada suatu studi menggunakan 400 isolat bakteri, dilakukan penentuan sifat gram dengan KOH menghasilkan 60% gram (–) dan 40% gram (+). Namun setelah dikonfirmasi dengan pewarnaan gram didapatkan 81% gram (-), 11% gram (+) dan 8% gram variabel. Peneliti lain yang menggunakan 466 isolat mendapatkan hasil 82,6% gram (-), 12,7% gram (+) dan 4,7% gram variabel dengan prosedur pewarnaan gram. Hampir semua isolat gram (–) dapat diputuskan gram (–) dengan metode KOH dan korelasi antara gram (+) dengan pewarnaan gram dan gram (–) KOH adalah kurang dari 88%. Semua gram variabel dalam penelitian ini ditentukan sebagai gram (–) dengan KOH.
Hasil pengujian diatas menunjukkan bahwa metode KOH umumnya menghasilkan hasil yang sama dengan metode pewarnaan gram tapi metode KOH tidak dapat menentukan sifat gram variabel. Gram variabel dalam pewarnaan gram ditampakkan dengan beberapa sel berwarna ungu dan lainnya merah jingga. Bakteri gram variabel yang diuji dengan KOH dapat menghasilkan gram (+) atau (–) seperti kelompok Coryneform (Corynebacterium, Arthrobacter dll). Dari kelompok ini beberapa terlihat gram (+) dan yang lain gram (–) (berlendir sedikit) menggunakan metode KOH.
Ditemukan juga tidak adanya reaksi yang berbeda (antara pewarnaan gram dengan metode KOH) pada kultur berumur muda (16-24 jam) atau kultur tua (2-10 bulan). Artinya hasil yang didapatkan dari kedua metode ini adalah sama. Namun studi baru-baru ini menunjukkan kultur Bacillus, Staphylococcus, dan Streptococcus yang berumur 4 minggu menghasilkan uji gram (+) (tidak ada lender) tapi setelah dikonfirmasi dengan pewarnaan gram, didapat adanya campuran sel antara ungu dan pink.
Pada umumnya jarang atau tidak terjadi kebingungan dalam memutuskan adanya lender atau tidak meskipun beberapa kultur bereaksi secaea lambat. Namun jika bakteri yang dicampur terlalu sedikit, dikhawatirkan hasilnya akan salah. Lebih baik pada saat melakukan uji ini menggunakan latar belakang warna hitam. Metode ini tidak disarankan pada kultur yang berusia beberapa minggu.
Dari uraian diatas dapat dinyatakan bahawa penentuan sifat gram dengan KOH 3% (disebut KOH string test) memiliki hasil yang sama dengan pewarnaan gram. Keunggulannya jelas terlihat yaitu sederhana, praktis, dan tidak time-consuming. Namun kekurangannya antara lain:
1. Tidak dapat sekaligus mengecek morfologi selnya sehingga tidak dapat mengetahui adanya kontaminan pada kultur yang tidak diketahui jenisnya.
2. Kultur (sel) yang digunakan lebih banyak daripada pewarnaan gram. Hal ini akan menimbulkan masalah jika bakteri uji memiliki koloni tunggal yang kecil dan adapula yang merekat dengan agar.
3. Tidak dapat mendeteksi gram variabel (telah dijelaskan).
Bagaimana bisa berlendir?
Secara teoretis gram (+) memiliki dinding sel yang tebal dan lemak yang tipis sedangkan gram (-) berlemak tebal dan berdinding sel tipis yang berada di ruang periplasma. KOH akan menyerang lemak (bilayer lipid) ini dan membuat sel gram (-) pecah. Pecahnya sel melepaskan materi genetik (DNA) yang merupakan substansi melimpah di dalam sel bakteri. Molekul DNA sangat panjang bersifat sticky strings (menyerupai lendir, getah atau dapat berarti lengket) yang memberikan hasil seperti lendir saat diangkat dengan jarum inokulum.
Pradhika E.I. 2009
Referensi
Buck, John D. 1982. Non Staining KOH Method for Determination of Gram Reaction Of Marine Bacteria. Applied and Environtmental Microbiology. Vol 44. No 4, p.992-993.
Moaledj, K. 1986. Comparison of Gram-staining and alternate methods, KOH test and aminopeptidase activity in aquatic bacteria: their application to numerical taxonomy. Journal of Microbiological Methods, Vol 5, p. 303-310.
Powers, E.M. 1995. Efficacy of the Ryu nonstaining KOH technique for rapidly determining gram reactions of food-borne and waterborne bacteria and yeasts. American Society for Microbiology.